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OECD 231: Screening-Programm für endokrine Disruptoren – Assay zur Amphibien-Metamorphose

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Ein endokriner Disruptor ist eine exogene Substanz oder Mixtur, die eine Funktion/Funktionen des endokrinen Systems verändert und in einem intakten Organismus, dessen Nachkommenschaft oder (Sub-)Populationen gesundheitsschädliche Wirkungen verursacht.

AUTOR:

Sarah Broadley, BSc (Hons), MSc, PGCE, Research Scientist IV, Specialty Pathology Services; Dr. Catherine Ross, DVM, MSc, MRCVS, Pathologist, Department of Pathology Covance Laboratories Ltd., Harrogate, UK

DATUM:

Januar 2021

Einführung

„Ein endokriner Disruptor ist eine exogene Substanz oder Mixtur, die eine Funktion/Funktionen des endokrinen Systems verändert und in einem intakten Organismus, dessen Nachkommenschaft oder (Sub-)Populationen gesundheitsschädliche Wirkungen verursacht“ WHO-ICPS, 2002

Aufgrund von Bedenken, Umweltchemikalien könnten bei Menschen und wilden Tieren unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, hat die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) der Überprüfung und Entwicklung von Leitlinien zum Screening und Test potenzieller endokriner Disruptoren höchste Priorität eingeräumt. Diese Tests beinhalten Verbesserungen an dem alle 28 Tage zu wiederholenden Test an Nagetieren (Testleitlinie 407) und dem Assay zur Amphibien-Metamorphose (AMA-Testleitlinie 231).

„Ein endokriner Disruptor ist eine exogene Substanz oder Mixtur, die eine Funktion/Funktionen des endokrinen Systems verändert und in einem intakten Organismus, dessen Nachkommenschaft oder (Sub-)Populationen gesundheitsschädliche Wirkungen verursacht“ WHO-ICPS, 2002

Aufgrund von Bedenken, Umweltchemikalien könnten bei Menschen und wilden Tieren unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, hat die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) der Überprüfung und Entwicklung von Leitlinien zum Screening und Test potenzieller endokriner Disruptoren höchste Priorität eingeräumt. Diese Tests beinhalten Verbesserungen an dem alle 28 Tage zu wiederholenden Test an Nagetieren (Testleitlinie 407) und dem Assay zur Amphibien-Metamorphose (AMA-Testleitlinie 231).

Regulierungen

Das OECD hat im Jahr 2018 ein überarbeitetes „Conceptual Framework“ zur Überprüfung und Bewertung disruptiver, endokrine Effekte verursachender Chemikalien veröffentlicht. Das „Conceptual Framework“ besteht aus fünf Ebenen und es wird als Toolbox genutzt.

Ebene 1 – Sortierung und Priorisierung auf Grundlage bestehender Informationen.

Ebene 2 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung mechanistischer Daten.

Ebene 3 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung von Daten über bestimmte endokrine Mechanismen und Effekte.

Ebene 4 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung von Daten über unerwünschte Nebenwirkungen endokriner Mechanismen.

Ebene 5 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung umfassender Daten über die Effekte endokriner und anderer Mechanismen.

Das Assay zur Amphibien-Metamorphose fällt, ebenso wie das Assay zur kurzfristigen Fischreproduktion, das Uterotropher Assay und das Hershberger-Assay, in Ebene 3.

Aktuell gibt es in der Europäischen Union keine gesetzlichen Anforderungen hinsichtlich der Nutzung spezieller Tests endokriner Störungen, sofern diese nicht verlangt wird.

In den Vereinigten Staaten sind Tests hingegen obligatorisch und die United States Environmental Protection Agency hat eine zweistufige Strategie entwickelt.

Stufe-1-Assays – Eine Auswahl an In-vitro- und In-vivo-Assays. Das Assay zur Amphibien-Metamorphose und das Assay zur kurzfristigen Fischreproduktion gehören zu diesen Tests.

Stufe-2-Assays – In-vivo-Assays, einschließlich Toxikologie-Studien bei Säugetieren der 2. Generation, Wachstum/Reproduktion von Amphibien, Vögel der 2. Generation, Fische der 2. Generation und Mysida der 2. Generation.

Assay zur Amphibien-Metamorphose

Materialien und Methoden

Das Assay zur Amphibien-Metamorphose (Amphibian Metamorphosis Assay, AMA) ist ein Screening-Assay zur empirischen Identifikation von Substanzen, die die normale Funktionsweise der Hypophysen-Schilddrüsen-Achse stören können. Es bietet einen bewährten, von der Schilddrüse abhängigen Prozess, der auf aktive Substanzen innerhalb der Achse reagiert. Es ist das einzige Assay, das Aktivitäten in der Schilddrüse von Tieren in der morphologischen Entwicklungsphase identifiziert.

Das Testdesign beinhaltet, dass die Larven des Xenopus laevis im Stadium 51 im Wasser 21 Tage lang mindestens drei unterschiedlichen Konzentrationen einer Testchemikalie ausgesetzt werden. Die Larvendichte beträgt 20 Kaulquappen pro Tank.

Messungen am 7. Tag

Es werden zufällig fünf Kaulquappen ausgewählt und auf ethische Art und Weise getötet. Sie werden abgespült, trocken getupft und das Gewicht wird bestimmt. Bei jeder Kaulquappe werden die Länge der hinteren Gliedmaßen, die Kopf-Rumpf-Länge und das Entwicklungsstadium bestimmt.

Messungen am 21. Tag

Die übrigen Kaulquappen werden aus dem Tank genommen und auf ethische Art und Weise getötet. Sie werden abgespült, trocken getupft und das Gewicht wird bestimmt. Bei jeder Kaulquappe werden die Länge der hinteren Gliedmaßen, die Kopf-Rumpf-Länge und das Entwicklungsstadium bestimmt.

Die Kaulquappen werden 48 bis 72 Stunden, entweder als vollständige Proben oder mit abgeschnittenem Kopf, einschließlich des Unterkiefers, in Davidson-Fixiermittel gegeben.

Pro Tank werden fünf Kaulquappen histopathologisch untersucht.

Histologische Vorbereitung

Gewebeentnahme – Der vollständige Kopf wird mit Paraffinwachs behandelt.

Einbettung – Der Kopf wird entweder ventral nach dorsal flach (Längsdarstellung (LS)) oder mit dem Schnitt nach unten (transverse Darstellung (TS)) eingebettet.

Mikrotomie – An der Schilddrüse werden fünf Schnitte durchgeführt und mit Hämatoxylin und Eosin eingefärbt.

Histopathologie

Die Diagnosekriterien beinhalten: Hypertrophie/Atrophie der Schilddrüse, Hypertrophie der Follikelzelle, Hyperplasie der Follikelzelle

Follikulärer Lumenbereich/Kolloidqualität und Höhe/Form der Follikelzelle

Abbildung 1: Schilddrüsen (Pfeile), Längsschnitt, 2-fache Vergrößerung.


Abbildung 2: Schilddrüsen (Pfeile), 10-fache Vergrößerung. Bar = 50 µm.


Abbildung 3: Schilddrüsen (Pfeile), Transversalschnitt, 2-fache Vergrößerung.


Abbildung 4: Schilddrüsen (Pfeile), Transversalschnitt, 10-fache Vergrößerung. Bar = 100 µm.

Ergebnisse

Ohne Entwicklungseffekte wurden histologische Auswirkungen auf die Schilddrüse nachgewiesen. Sollten histopathologische Veränderungen in der Schilddrüse bemerkt werden, ist die Chemikalie als aktiv zu bewerten. Sollten keine Verspätungen in der Entwicklung und keine histopathologischen Veränderungen in der Schilddrüse bemerkt werden, ist die Chemikalie als inaktiv zu bewerten. Dies liegt daran, dass das Thyroidea-stimulierende Hormon (TSH) und andere, sich auf das zirkulierende Schilddrüsenhormon auswirkende Chemikalien, durch Einfluss auf die TSH-Sekretion zu histopathologischen Veränderungen in der Schilddrüse​​​​​​​ führen.

Verweise

OECD (2018), Revised Guidance Document 150 on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption, OECD Series on Testing and Assessment, OECD Publishing, Paris. https://doi.org/10,18/9789264304741-en

OECD (2009), Test No. 231: Amphibian Metamorphosis Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10,18/9789264076242-en.

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