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OECD 229: Screening-Programm für endokrine Disruptoren – Assay zur kurzfristigen Fishreproduktion

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Ein endokriner Disruptor ist eine exogene Substanz oder Mixtur, die eine Funktion/Funktionen des endokrinen Systems verändert und in einem intakten Organismus, dessen Nachkommenschaft oder (Sub-)Populationen gesundheitsschädliche Wirkungen verursacht.

AUTOR:

Sarah Broadley, BSc (Hons), MSc, PGCE, Research Scientist IV, Specialty Pathology Services; Dr. Catherine Ross, DVM, MSc, MRCVS, Pathologist, Department of Pathology Covance Laboratories Ltd., Harrogate, UK

DATUM:

Januar 2021

Einführung

„Ein endokriner Disruptor ist eine exogene Substanz oder Mixtur, die eine Funktion/Funktionen des endokrinen Systems verändert und in einem intakten Organismus, dessen Nachkommenschaft oder (Sub-)Populationen gesundheitsschädliche Wirkungen verursacht“ WHO-ICPS, 2002

Das Screening-Programm für endokrine Disruptoren (Endocrine Disruptor Screening Program, EDSP) ist eine Initiative zur Bestimmung, ob Pestizide, Chemikalien oder andere Substanzen aufgrund von Störungen des endokrinen Systems Risiken für die menschliche Gesundheit oder die Umwelt darstellen. Dieses Assay zur kurzfristigen Reproduktion (Testleitlinie 229) ist durch die Dickkopfelritze (Pimephales promelas) und eine Teilmenge des Medaka und des Zebrafischs validiert. Das Assay berücksichtigt die Reproduktivität als integrativen Messwert toxischer Auswirkungen mithilfe einer Suite an histologischen und biochemischen Endpunkten in Bezug auf die Auswirkungen durch die Störung der endokrinen Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (Hypothalamus-Pituitary-Gonadal, HPG).

Regulierungen

Das OECD hat im Jahr 2018 ein überarbeitetes „Conceptual Framework“ zur Überprüfung und Bewertung disruptiver, endokrine Effekte verursachender Chemikalien veröffentlicht. Das „Conceptual Framework“ besteht aus fünf Ebenen und es wird als Toolbox genutzt.

Ebene 1 – Sortierung und Priorisierung auf Grundlage bestehender Informationen.

Ebene 2 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung mechanistischer Daten.

Ebene 3 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung von Daten über bestimmte endokrine Mechanismen und Effekte.

Ebene 4 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung von Daten über unerwünschte Nebenwirkungen endokriner Mechanismen.

Ebene 5 – In-vitro-Assays zur Bereitstellung umfassender Daten über die Effekte endokriner und anderer Mechanismen.

Das Assay zur kurzfristigen Fischreproduktion fällt, ebenso wie das Assay zur Amphibien-Metamorphose, das Uterotropher Assay und das Hershberger-Assay, in Ebene 3.

Aktuell gibt es in der Europäischen Union keine gesetzlichen Anforderungen hinsichtlich der Nutzung spezieller Tests endokriner Störungen, sofern diese nicht verlangt wird.

In den Vereinigten Staaten sind Tests hingegen obligatorisch und die United States Environmental Protection Agency hat eine zweistufige Strategie entwickelt.

Stufe-1-Assays – Eine Auswahl an In-vitro- und In-vivo-Assays. Das Assay zur kurzfristigen Fischreproduktion und das Assay zur Amphibien-Metamorphose gehören zu diesen Tests.

Stufe-2-Assays – In-vivo-Assays, einschließlich Toxikologie-Studien bei Säugetieren der 2. Generation, Wachstum/Reproduktion von Amphibien, Vögel der 2. Generation, Fische der 2. Generation und Mysida der 2. Generation.

Assay zur kurzfristigen Fischreproduktion

Materialien und Methoden

Dieser Test erfordert drei Konzentrationen und Kontrollen.

Pro Behandlung der Zebrafische werden zwei Gefäße benötigt (in jedem Gefäß befinden sich 5 männliche und 5 weibliche Fische).

Pro Behandlung der Dickkopfelritzen werden vier Gefäße benötigt (aufgrund des ausgeprägten Territorialverhaltens der männlichen Dickkopfelritzen befinden sich in jedem Gefäß 2 männliche und 4 weibliche Fische).

Pro Behandlung der Medakas werden vier Gefäße benötigt (in jedem Gefäß befinden sich 3 männliche und 3 weibliche Fische).

Die folgenden Parameter werden bewertet:

Analytische Chemie – Wöchentliche Entnahme von Wasserproben aus den Tanks zur Analyse des Gehalts der Testchemikalien.

Vitellogenine (Vg) – Es werden ELISA-Methoden genutzt, um den Gehalt dieses Dottervorläuferproteins zu bestimmen. Vg kommt üblicherweise nur in weiblichen Fischen vor und ist in männlichen Fischen nicht vorhanden. Allerdings lässt sich bei männlichen Fischen, wenn diese endokrinen Disruptoren ausgesetzt werden, ebenfalls Vg feststellen, wobei der Vg-Gehalt von der Dosis abhängt. Daher wird die Vg-Genexpression in männlichen Fischen genutzt, um den Gehalt an östrogenen, endokrinen Disruptoren zu bestimmen.

Morphologische Beobachtungen – Die Präsenz sekundärer Geschlechtsmerkmale lässt sich wie folgt erkennen und beobachten: Farbe des männlichen Fischs und Fettpolster (Präsenz und Gewicht bei Abschluss), Mapping nuptiler Tuberkel, tägliche Überwachung des Überlebens und Verhaltens.

Der Befruchtungserfolg wird bewertet, die Fischembryos werden visuell inspiziert und die unfruchtbaren und fruchtbaren Eier werden gezählt.

Fruchtbarkeit – Die Anzahl der täglich produzierten Eier wird ermittelt.

Überleben, Verhalten und Aussehen – Die Fische werden täglich überwacht, um Todesfälle und abweichendes Verhalten im Vergleich zu den Kontrollen festzustellen.

Beobachtung sekundärer Geschlechtsmerkmale – Es werden sekundäre Geschlechtsmerkmale wie nuptile Tuberkel bei der männlichen Dickkopfelritze und papilläre Prozesse bei Medakas beobachtet.

Abbildung 1: Diese Abbildung zeigt nuptile Tuberkel einer männlichen Dickkopfelritze. Die Anzahl und Größe der Tuberkel werden mithilfe einer Vorlage wie folgt bestimmt und eingestuft: 0 – nicht vorhanden, 1 – vorhanden, 2 – vergrößert und 3 – ausgeprägt.

Quelle der Abbildung: OECD (2012), Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, Paris. https://doi.org/10,18/9789264185265-en.

Histologische Vorbereitung

Gewebeentnahme/Gewebeverarbeitung

Dickkopfelritzen – Die Gonaden des Fischs werden abgetrennt und mit Paraffinwachs behandelt.

Medakas und Zebrafische – Bei Bedarf wird das Gerippe des Fischs abgetrennt und der Rumpf wird mit Paraffinwachs behandelt.

Einbettung – Die Gonaden werden/Der Fisch wird in horizontal in Längsausrichtung positioniert.

Mikrotomie – An den Gonaden werden mittig drei Schnitte durchgeführt und mit Hämatoxylin und Eosin eingefärbt.

Histopathologie

Männliche FIsche – die primären Diagnosekriterien beinhalten: Gesteigerte Anzahl an Spermien/Eizellen

Erhöhte testikuläre Degeneration

Hyperplasie/Hypertrophie der interstitiellen Zelle (Leydig-Zelle)

Männliche Fische – die sekundären Diagnosekriterien beinhalten:

Verringerte Anzahl an Spermatogonien

Erhöhte vaskuläre oder interstitielle, eiweißhaltige Flüssigkeit, asynchrone Gonadenentwicklung

Veränderte Anzahl an Spermatozyten oder Spermatiden, Änderungen der Gonadenstadien

Granulomatöse Entzündung

Abbildung 1: Gonade einer männlichen Dickkopfelritze, 20-fache Vergrößerung. Bar = 50 µm.


Gonade einer männlichen Dickkopfelritze, 40-fache Vergrößerung.

Abbildung 2: Gonade einer männlichen Dickkopfelritze, 40-fache Vergrößerung. Bar = 20 µm. Bitte beachten Sie die Anordnung der Spermienentwicklung um die Läppchen: (1) 1˚ Spermatogonien; (2) 2˚ Spermatogonien; (3) 1˚ Spermatozyten; (4) 2˚ Spermatozyten; (5) Spermatozoen.

Histopathologie

Weiblich FIsche – die primären Diagnosekriterien beinhalten

Erhöhte Oozytenatresie

Hyperplasie/Hypertrophie der parafollikulären Zelle, verringerte Eiproduktion

Änderungen der Gonadenstadien

Weibliche FIsche – die sekundären Diagnosekriterien beinhalten:

Interstitielle Fibrose

Granulomatöse Entzündung, verringerte Anzahl an ostovulatorischen Follikeln

Gonade einer weiblichen Dickkopfelritze, 4-fache Vergrößerung

Abbildung 3: Gonade einer weiblichen Dickkopfelritze, 4-fache Vergrößerung. Bar = 200 µm. Bitte beachten Sie die Stadien der Eizellentwicklung in beiden Abbildungen: (1) Perinukleäre Eizellen; (2) Kortikale alveoläre Eizellen; (3) Frühvitellogene Eizellen; (4) Spätvitellogene Eizellen.


Gonade einer weiblichen Dickkopfelritze, 40-fache Vergrößerung

Abbildung 4: Gonade einer weiblichen Dickkopfelritze, 40-fache Vergrößerung. Bar = 20 µm.

Ergebnisse

Das Assay zur kurzfristigen Fischreproduktion ist ein Screening-Test zur Indikation potenzieller endokriner Aktivitäten. Es dient nicht zur Bestätigung spezifischer Mechanismen, Wirkungsweisen oder Nebenwirkungen. Daher können statistisch signifikante Effekte an einem oder mehereren Endpunkten des Assays potenzielle Störungen der HPG-Achse bei Fischen durch das Testmaterial andeuten.

Verweise

OECD (2018), Revised Guidance Document 150 on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption, OECD Series on Testing and Assessment, OECD Publishing, Paris. https://doi.org/10,18/9789264304741-en

OECD (2012), Test No. 229: Fish Short Term Reproduction Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD Publishing, Paris. https://doi.org/10,18/9789264185265-en.

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