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Modellierung der Immunonkologie in einer humanisierten Maus

Autorin: Patrick Allison, PhD
Date: February 2020


Immunschwache Mäuse verfügen über kein adaptives Immunsystem, was sie zu idealen Kandidaten für die Transplantation und das Wachstum von menschlichen Tumorzellen macht. Präklinische Xenotransplantat-Modelle und der Einsatz von immunschwachen Mäusen begrenzen sich auf die Erforschung von Immuntherapien aufgrund der fehlenden, funktionierenden Immunzellen. Dieses Spotlight hebt eine Methode hervor, bei der sich menschliche T-Lymphozyten in einer immunschwachen Maus vermehren und das Xenotransplantat unterstützen.

NOD-scid IL2Rγnull(NSG)-Mäuse, in die menschliche mononukleäre Peripherblutzellen (hPBMCs) transplantiert wurden, werden bei Xenotransplantat-Modellen mit Erfolg eingesetzt, um die Wirksamkeit und die pharmacodynamischen Daten des Immuncheckpunkt-Inhibitors, der auf Epitope auf menschlichen T-Lymphozyten 1 wirkt. Dieses Modell setzt sich von konventionellen Xenotransplantat-Modellen dahingehend ab, indem funktionelle menschliche T-Zellen Auswirkungen auf menschliche Epitope von in eine Maus implantierte Tumore haben und unmittelbar übertragbare klinische Signifikanz aufweisen. NSG-Mäuse verfügen eine zu geringe Anzahl dendritischer Zellen und Makrophagen und weisen zwei spezifische Mutationen auf, welche die Zellpopulation von Lymphozyten gravierend einschränken: Die Pkrdc-Mutation setzt Aspekte der DNA-Reparatur außer Kraft und die Entfernung von IL2Rγ blockiert die Zellreifung der NK-Zellen2. Die Kombination dieser Defizite ermöglicht die Implantation von hPBMC und ermöglicht die Verbreitung der menschlichen T-Lymphozyte in der NSG-Maus.

Die in die NSG-Maus implantierte hPBMC hat jedoch auch Einschränkungen, die vor der Auswahl des menschlichen Spenders und des Tumormodells bewertet werden müssen. Erstens, die Verabreichung menschlicher Immunzellen in eine Maus führt zu einer von T-Zellen eingeleitete Toxizität, die der Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (graft versus host disease, GvHD) entspricht, bei der menschliche Lymphozyten das Gewebe der Maus angreifen und das Behandlungsfenster begrenzen3. Zweitens, Effizienz des Implantats, vorhandene Zellarten und Zellaktivität unterscheiden sich Beobachtungen zufolge bei unterschiedlichen menschlichen Spendern4. Abschließend haben wir Fälle der hPBMC-Abstoßung des menschlichen Tumorimplantats beobachtet. Die Bewertung der Parameter der Spenderquelle und des ausgewählten Tumormodells vor Beginn einer Wirksamkeitsstudie ist für den Erfolg von translationalen frühen Entwicklungsprogrammen unumgänglich.

Experimentelles Design

Das Ziel dieser Studie ist die Bewertung der Implantation menschlicher T-Lymphozyten von menschlicher mononukleärer Peripherblutzellen, die NSG-Mäusen mit subkutanen menschlichen Xenotransplantaten verabreicht werden. Die Pflege und Nutzung der Tiere fand gemäß dem Handbuch für die Pflege und Nutzung von Labortieren fand in einer von AAALAC akkreditierten Einrichtung statt. NSG-Mäuse (Jackson Laboratories, Bar Harbor Maine, USA, Stammnummer 0005557) mit subkutanen MiaPaCa-2 menschlichen duktalen Adenokarzinomen wurden intravenös hPBMCs von vier unterschiedlichen, normalen, gesunden Spendern verabreicht (Hemacare, Los Angeles CA, USA). Die Bewertung umfasste Tumorwachstum, Körpergewicht und GvHD-nahe Eigenschaften. Zur Analyse der Durchflusszytometrie von menschlichen Lymphozyt-Markern wurde zur Bestätigung der Spender-Implantation von CD45+-Zellen, einschließlich CD4+- und CD8+-Zellen, an Tagen 14, 28 und 42 nach der Verabreichung von hPBMC Vollblut abgenommen (Abbildung 1).

Abbildung 1 – Experimentelles Design zur Bewertung des hPBMC-Implantation in NSG-Mäusen mit MiaPaca-2-Tumor.

Abbildung 1 – Experimentelles Design zur Bewertung des hPBMC-Implantation in NSG-Mäusen mit MiaPaca-2-Tumor.

Tumorwachstum, Körpergewicht und Krankheitsfortschritt

Verdopplungszeit des Tumors (Td) MiaPaCa-2 bei unbehandelten Kontrolltieren belief sich auf 9,1 Tage, Td der Tiere, denen hPBMC verabreicht wurden, reichte von 8,7 bis 11,6 Tage bei jeder Spendergruppe. Abweichungen des Tumorwachstums wurden bei allen Teilnehmern, denen hPBMC verabreicht wurden, über die 30 Tage nach der Implantation hinaus beobachtet. Die Implantation von hPBMC hatte keine Auswirkungen auf Tumorwachstum von weniger als 1000 mm3 (Abbildung 2). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass sich alle eingesetzten Spender für die Wirksamkeitsstudien von MiaPaCa2 mit einer Dauer bis zur Evaluierungsgröße (time to evaluation size, TES) von 1000 mm3 eignen.

Abbildung 2 – Tumorwachstum des subkutanen MiaPaCa2-Tumors (n = 10) nach Verabreichung von hPBMC.

Abbildung 2 – Tumorwachstum des subkutanen MiaPaCa2-Tumors (n = 10) nach Verabreichung von hPBMC.

Auftreten der Symptome, die auf GvHD hindeuten, wurden anhand des Körpergewichts und klinischer Beobachtungen überwacht. Die beobachteten Symptome stimmen stark mit den Symptomen der Krankheit überein, auch wenn diese in dieser Studie nicht pathologisch bestätigt wurden5. Die Symptome umfassten Gewichtsverlust (Abbildung 3) von mehr als 10 % Baseline, raues Fell, gekrümmte Haltung, Hautläsionen und  Durchfall. Tiere, die alle Symptome aufwiesen oder mehrere mit starken Auswirkungen, wurden von der Studie entfernt. 32 Tage nach der hpBMC-Injektion wurden klinische Anzeichen bei mehr als der Hälfte der Tiere aus jeder Gruppe festgestellt. Tiere, die nicht wegen ihrer GvHD-Symptome aus der Studie entfernt wurden, wurden aufgrund von Tumorgrößen von mehr als 2000 mm3 oder bei Abschluss der Studie entfernt.

Abbildung 3 – Feststellung der Veränderungen des Körpergewichts nach der Verabreichung von hPBMC

Abbildung 3 – Feststellung der Veränderungen des Körpergewichts nach der Verabreichung von hPBMC

Implantation und Beständigkeit von menschlichen Lymphozyten

An Tagen 14, 28 und 42 nach der hPBMC-Verabreichung wurde das Einwachsen des Transplantats anhand von immunphänotypischer Analyse der menschlichen Immunzellenmarkern im Peripherblut von NSG-Mäusen gemessen: mCD45 (muriner Pan-Leukozyt), hCD45 (menschlicher Pan-Leukozyt), hCD3 (Pan-T-Zelle), hCD4 (T-Helfer-Zellen und TReg-Zellen) und hCD8 (zytotoxische Lymphozyte) wurden in der Durchflusszymetrie festgestellt (Abbildung 4).

Auftreten der Symptome, die auf GvHD hindeuten, wurden anhand des Körpergewichts und klinischer Beobachtungen überwacht. Die beobachteten Symptome stimmen stark mit den Symptomen der Krankheit überein, auch wenn diese in dieser Studie nicht pathologisch bestätigt wurden5. Die Symptome umfassten Gewichtsverlust (Abbildung 3) von mehr als 10 % Baseline, raues Fell, gekrümmte Haltung, Hautläsionen und  Durchfall. Tiere, die alle Symptome aufwiesen oder mehrere mit starken Auswirkungen, wurden von der Studie entfernt. 32 Tage nach der hpBMC-Injektion wurden klinische Anzeichen bei mehr als der Hälfte der Tiere aus jeder Gruppe festgestellt. Tiere, die nicht wegen ihrer GvHD-Symptome aus der Studie entfernt wurden, wurden aufgrund von Tumorgrößen von mehr als 2000 mm3 oder bei Abschluss der Studie entfernt.

Abbildung 4 – Beispiel einer Gating-Strategie für die Entdeckung menschlicher Immunzellen in NSG-Mäusen, die mit hPBMC rekonstituiert wurden.

Abbildung 4 – Beispiel einer Gating-Strategie für die Entdeckung menschlicher Immunzellen in NSG-Mäusen, die mit hPBMC rekonstituiert wurden.

Der Prozentwert hCD45+ wird als Prozentwert der hCD45+-Zellen der Gesamtanzahl lebendiger Zellen berechnet (basierend auf absoluten Zellzahlen/µL Vollblut) und zählt als Indikator des Ausmaßes der hPBMC-Implantation. Wir haben nach einem gewissen Zeitraum %hCD45+-Zellen im Vollblut aller Spender festgestellt (Abbildung 5). Jedoch zeigte sich bei Spendern 2 und 4 beim Fokus auf die Einzelfälle ein größerer Zuwachs an hCD45-Zellen. Beim Vergleich mit Spendern 1 und 3, ergab sich, dass ihre Implantatwerte bis zum Tag 42 nach der Verabreichung von hPBMC nicht an die Werte der ersten beiden Spender heranreichten.  Animals across all groups achieved %hCD45 engraftment levels 28 days post hPBMC administration that is consistent with published literature on the model6.

Die Verabreichung von hPBMC bei NSG-Mäusen führt zum Fortbestand der menschlichen T-Zellen im Körper der Maus bei gleichzeitigen minimalen Auswirkungen auf das MiaPaCa-2 -Tumorwachstum. Dieses Modell repräsentiert eine aussagekräftige präklinische Plattform für die Auswertung der Auswirkungen neuer Wirkstoffe, die menschliche T-Lymphozyten zur Tumorbekämpfung mit unmittelbarer klinischer Bedeutung anregt. Künftige Arbeit mit diesem Modell wird die Wirksamkeit der von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA)-genehmigten Immuntherapien gegen Xenotransplantate menschlicher Tumore bei NSG-Mäusen, die mit hPBMC rekonstituiert wurden, belegen.

Abbildung 5 – Umfang der Implantation von hCD45+-Zellen, die nach der Verabreichung von hPBMC im Vollblut von NSG-Mäusen festgestellt wurden

Abbildung 5 – Umfang der Implantation von hCD45+-Zellen, die nach der Verabreichung von hPBMC im Vollblut von NSG-Mäusen festgestellt wurden


Bitte
contact our preclinical oncology scientists to see how hPBMC engrafted NSG mice can be used for your next translational immuno-oncology study.


Verweise

1Cancer Res; 2015 (75) 17: 3466-3478
2Cold Spring Harbor Protocols; 2014 (7): 694–708.
3Frontiers in Immunology; 2018 (9): 43.
4FASEB; 2019 (33):3137-3151.
5Frontiers in Immunology; 2018 (9): 10.
6Current Protocols in Immunology,  Kapitel 15: Abschnitt 15.21.
 
Bitte beachten Sie, dass die gesamte Tierpflege und -nutzung gemäß den Tierschutzbestimmungen in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung mit Überprüfung und Genehmigung des IACUC-Protokolls durchgeführt wurde.

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