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Messung der Tumorantigen-spezifischen Immunität mit ELISpot und FluoroSpot

Autorin: David Draper
Date: March 2020


Die Verbesserung der Reaktion durch Tumorantigene ist eines der Ziele der Immuntherapie. Sei es die Förderung der Tumorimmunität oder der Aufbau einer immunologischen Gedächtnisreaktion: Wirkstoffe, die die Immunreaktion aktiv fördern, zeigen ein höheres Potenzial, klinische Erfolge zu ermöglichen1.

Obwohl es viele Assays zur Ermittlung der Spezifität von Antigenen gibt, sind viele davon einschränkend, da sie die Nutzung modellspezifischer Reagenzstoffe, genetisch erzeugter Tiere oder nachfolgender Schritte der Zellreinigung erfordern. Our Preclinical Oncology offers a simplistic and affordable solution through ELISpot/FluoroSpot analysis.

Die auf der ELISA-Technologie basierenden ELISpot- und FluoroSpot-Analysen messen die Frequenz von Zellen, die lösliche Targets produzieren und freigeben. Wir stellen Kits zur Verfügung, mit denen Sie zahlreiche unterschiedliche Targets wie Zytokine, Chemokine, Immunglobuline und Wachstumsfaktoren messen können. We offer single color enzyme-linked immuno-spot analysis of one target (ELISpot) as well as multi-color fluorescence-based analysis of up to 3 targets simultaneously (FluoroSpot). Nachfolgende Abbildung 1 zeigt das FluoroSpot-Verfahren zur Analyse tumorspezifischer, IFNγ und IL-4 produzierender Zellen.

Abbildung 1: ELISpot-/FluoroSpot-Verfahren

Abbildung 1: ELISpot-/FluoroSpot-Verfahren

Abbildung 2 zeigt die Anwendung der ELISpot-/FluoroSpot-Verfahren in der präklinischen immunonkologischen Forschung mithilfe des Hepa1-6-luc-Leberzellkarzinommodells. Wir haben mithilfe des FluoroSpot-Verfahrens die tumorspezifische Immunität des peripheren Bluts einer tumortragenden Maus gemessen und dabei herausgefunden, dass die In-vivo-Checkpoint-Hemmung bei einer Anti-PD-1-Behandlung die Anzahl tumorspezifischer, IFNγ produzierender Zellen erhöht. Außerdem verändert eine Anti-PD-1-Behandlung das IFNγ/IL-4-Profil, sodass dieses nun nicht mehr eine immunsuppressive, sondern eine proinflammatorischere Anti-Tumor-Reaktion zeigt.

Abbildung 2: FluoroSpot-Analyse der Tumorimmunität einer Maus mit Hepa1-6-luc. C57BL/6-Mäusen mit etablierten Hepa1-6-luc-Tumoren wurden Anti-PD-1- oder Antikörper zur Isotypkontrolle verabreicht. Weiße Blutkörper in 200 µL peripherem Blut wurden mit bestrahlten Hepa1-6-luc-Zellen kultiviert. A) Quantifizierung der Frequenz IFNγ und IL-4 produzierender Zellen mithilfe eines CTL ImmunoSpot® S6 Universalanalysators. B) Analyse der Frequenz der IFNγ produzierenden Zellen im Vergleich zum Tumorvolumen in jeder Maus. C) Bestimmung des Th1/Th2-Verhältnisses durch Bestimmung des Anteils IFNγ und IL-4 produzierender Zellen.


Abbildung 2: FluoroSpot-Analyse der Tumorimmunität einer Maus mit Hepa1-6-luc. C57BL/6-Mäusen mit etablierten Hepa1-6-luc-Tumoren wurden Anti-PD-1- oder Antikörper zur Isotypkontrolle verabreicht. Weiße Blutkörper in 200 µL peripherem Blut wurden mit bestrahlten Hepa1-6-luc-Zellen kultiviert. A) Quantifizierung der Frequenz IFNγ und IL-4 produzierender Zellen mithilfe eines CTL ImmunoSpot® S6 Universalanalysators. B) Analyse der Frequenz der IFNγ produzierenden Zellen im Vergleich zum Tumorvolumen in jeder Maus. C) Bestimmung des Th1/Th2-Verhältnisses durch Bestimmung des Anteils IFNγ und IL-4 produzierender Zellen.

Ähnlich wie die Wirkung eines Impfstoffs ruft ein wachsender Tumor eine Immunreaktion hervor, die das Entstehen tumorspezifischer, Antikörper und Zytokine produzierender Zellen beinhaltet.1 Die Stärke der Immunreaktion kann durch die Prüfung von IFNγ und IL-4 gemessen werden. Es ist bekannt, dass IFNγ durch eine Stärkung der T-Zell-vermittelten Immunreaktion durch Zytotoxizität das Tumorwachstum hemmt. Im Gegensatz dazu fördert IL-4 durch verschiedene immunosuppressive Effekte das Tumorwachstum. Dieser Gegensatz wird oft als Th1/Th2-Verhältnis bezeichnet2. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wurde durch Anti-PD-1-Behandlung nach einer Ex-vivo-Stimulation die Frequenz tumorspezifischer, IFNγ produzierender Zellen gesteigert. Im Gegensatz dazu wurde die Frequenz IL-4 produzierender Zellen nicht signifikant erhöht. Dies deutet darauf hin, dass die Checkpoint-Hemmung die Tumorimmunität gesteigert hat. Dafür spricht ebenfalls die Tatsache, dass in Mäusen mit den höchsten Frequenzen IFNγ produzierender Zellen die kleinsten Tumore beobachtet werden konnten. Außerdem steigerte die Anti-PD-1-Behandlung die Frequenz IFNγ und IL-4 produzierender Zellen. Bei diesen Mäusen konnten ebenfalls die kleinsten Tumore beobachtet werden.

Diese aus dem ELISpot- und dem FluoroSpot-Verfahren gewonnenen Daten zeigen eindeutig die Wirksamkeit von Wirkstoffen auf die tumorspezifische Immunreaktion. Außerdem können das ELISpot- und das FluoroSpot-Verfahren in Wirksamkeitsstudien mit einer Behandlungsgruppe eingesetzt werden, da bei dem Assay jeweils nur eine geringe Blutmenge benötigt wird. Somit ist die Möglichkeit gegeben, Einblicke in die Wirkweise von Wirkstoffen zu gewinnen, ohne dass im Rahmen der Studie eine weitere Behandlungsgruppe hinzugefügt werden muss. For more information on how ELISpot/FluoroSpot can be applied to your preclinical oncology and immuno-oncology research, contact the scientists at Labcorp Preclinical Oncology.


Verweise

1. Immunity; 52,1 (2020): 36-54
 
2. Cancer Immunology, Immunotherapy; 57,8 (2008): 1125-1136.
 
Bitte beachten Sie, dass die gesamte Tierpflege und -nutzung gemäß den Tierschutzbestimmungen in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung mit Überprüfung und Genehmigung des IACUC-Protokolls durchgeführt wurde.

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