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Functional analysis of tumor infiltrating lymphocytes by flow cytometry using the cytokine/cytotoxicity™ panel

Autorin: David Draper, PhD
Date: August 2020


Entzündungsfördernde Zytokinreaktionen in Verbindung mit der Expression von Granzym B und CD107a (LAMP-1) sind wertvolle Biomarker in der Immunonkologie1-3. Zellbasierte Assays, die die Expression dieser Ziele in von Tumoren abgeleiteten Effektorlymphozyten quantifizieren können, liefern Einblicke in den Wirkungsmechanismus von Wirkstoffkandidaten. The preclinical oncology group offers a new off-the-shelf assay that utilizes the Cytokine/Cytotoxicity standard flow cytometry panel to quantify these endpoints in T cells, natural killer (NK) and natural killer T cell (NKT) subsets. Dieser Artikel zeigt, wie das Cytokine/Cytotoxicity™-Panel in In-vivo-Studien integriert werden kann und in Kombination mit der konventionellen Immunphänotypisierung dazu beiträgt, solide Datensätze während der präklinischen Wirkstoffentwicklung zu erstellen.

Zytokine, einschließlich IFN1, TNFα und IL-2, weisen eine Antitumoraktivität auf, indem sie die grundlegende und adaptive Aktivierung von Immunzellen und die Proliferation von T-Zellen in der Tumormikroumgebung fördern. In-vivo-Therapien, die das Tumorwachstum durch T-Zell-Aktivierung hemmen (durch direkte oder indirekte Mechanismen), erhöhen oftmals die Häufigkeit von Tumor-infiltrierenden T-Zellen, die darauf vorbereitet sind, heftig auf Ex-vivo-Stimulation zu reagieren. Es wurde gezeigt, dass in NK- und NKT-Zellen in Bezug auf das Priming und die anschließende IFNγ/TNFα-Produktion ähnliche Effekte auftraten. Zusätzlich zur Zytokinproduktion kann eine In-vivo-Behandlung Effektorlymphozyten dazu veranlassen, erhöhte zytotoxische Eigenschaften zu erwerben, die die Tumorlyse durch direkten Kontakt von Zellen ermöglichen. Dieser Prozess wird gesteuert durch die Expression und Freisetzung von Perforinen und Granzymen aus zytolytischen Granulaten, die in den Immunzellen gespeichert sind. Diese Toxine zerstören die Zellmembran und induzieren Apoptose in der Zieltumorzelle. Darüber hinaus findet die Degranulation gleichzeitig mit der Expression von CD107a auf der Oberfläche der Effektorzelle statt und kann somit als Marker für die zytotoxische Aktivität verwendet werden.

Die oben beschriebenen Punkte können zusammen profiliert werden, um den Aktivierungszustand von Lymphozyten-Untergruppen in der Tumormikroumgebung zu untersuchen. Das Cytokine/Cytotoxicity-Panel ermöglicht diese Messungen durch Kombination der Zelloberflächen-Immunphänotypisierung unter Verwendung von T-Zell-, NK- und NKT-Zell-spezifischen Antikörpern mit intrazellulärer Färbung für Zytokine und Granzym-B-Expression (Tabelle 1).

Tabelle 1: Cytokine/Cytotoxicity™-Panel

Antikörper / Farbstoff

Beschreibung

CD45

Pan-hämatopoetischer Zellmarker

CD3

Pan T-Zell-Marker

CD4

CD4+-T-Zell-Marker

CD8

CD8+-T-Zell-Marker

CD49b/CD335

Natürliche Killerzell-/Natürliche-Killer-T-Zell-Marker

IFNγ

Entzündungsförderndes Zytokin

TNFα

Entzündungsförderndes Zytokin

IL-2*

T-Zell-Aktivator

Granzyme B

Zytotoxizitätsmarker

CD107a

Degranulationsmarker

Vitalitätsfarbstoff

Ausschluss toter Zellen

*IL-2 kann durch andere Zytokine ersetzt werden, darunter IL-4 und IL-17a

Analyse von Zytokinen und Granzym B in aus 4T1-luc-Tumor abgeleiteten Effektorzellen nach Bestrahlung und Anti-mCTLA-4-Therapie

Die Nützlichkeit des Cytokine/Cytotoxicity-Panels zur Messung von Zytokinen und Granzym B wird in diesem Datensatz unter Verwendung des murinen 4T1-luc-Mammakarzinom-Modells demonstriert. Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie zur Abgrenzung von T-Zell- und NK-Zell-Teilmengen. Wie bei allen unseren präklinischen Durchflusszytometrie-Panels für die Onkologie beginnt die Analyse mit dem Ausschluss toter Zellen und der anschließenden Abgrenzung von CD45+-Immunzellen, um interessante Immununtergruppen zu identifizieren (nicht dargestellt). Dargestellt sind repräsentative Profile von IFNγ, TNFα, IL-2 und der Granzym-B-Expression nach PMA/Ionomycin-Stimulation.

Abb. 1: Gating von entzündungsfördernden Zytokinen und Granzym B in Lymphozyten-Untergruppen durch Durchflusszytometrie
Abb. 1: Gating von entzündungsfördernden Zytokinen und Granzym B in Lymphozyten-Untergruppen durch Durchflusszytometrie

Die 4T1-luc-Tumormikroumgebung ist stark immunsuppressiv und ist durch das Vorhandensein eines großen granulozytisch-myeloisch-abgeleiteten Suppressorzellinfiltrats (nicht dargestellt) gekennzeichnet. 4T1-luc ist ein Modell, von dem bekannt ist, dass es gegen Behandlungen mit Checkpoint-Hemmstoffen resistent ist. In Kombination mit Strahlung von der Small Animal Radiation Research Platform (SARRP, Xstrahl) verbessert Anti-mCTLA-4 jedoch die Hemmung des Tumorwachstums von 4T1-luc-Tumoren (Abbildung 2A, links). Die Hemmung des Tumorwachstums ist wahrscheinlich nicht auf einen behandlungsinduzierten Anstieg der Rekrutierung von Effektorzellen zurückzuführen, da die Durchflusszytometrie keine erhöhte Anzahl von T-Zellen oder NK-Zellen im Tumor nach In-vivo-Behandlung zeigt, verglichen mit der Isotyp-Kontrollgruppe (Abbildung 2A, rechts). Die Ex-vivo-Stimulation von Tumorzellen mit PMA/Ionomycin zeigt jedoch, dass CD8+-T-Zellen eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von IFNγ aufweisen. Darüber hinaus exprimieren NK-Zellen im Vergleich zu Kontrollgruppen höhere Mengen an Granzym B (Abbildung 2B). Diese Daten legen nahe, dass eine kombinierte Behandlung mit Bestrahlung und Anti-mCTLA-4 den Aktivierungszustand von CD8+-T-Zellen und NK-Zellen verbessert. Dies verdeutlicht den Wert der Einbeziehung mechanistischer Marker in Studien, in denen Wirksamkeit und Immunphänotypisierung angestrebt werden.

Abbildung 2: Analyse der entzündungsfördernden Reaktion in Effektorzellen im 4T1-luc-Modell. BALB/c-Mäuse mit etablierten 4T1-luc-Tumoren (n=6/Gruppe) wurden mit Anti-mCTLA-4 (Klon 9D9), fokaler Strahlung („RAD“; SARRP, Xstrahl Inc.), einer Kombination der beiden oder Isotyp-Kontrollantikörper behandelt. Die Tumore wurden in Einzelzellsuspensionen (gentleMACS™, Miltenyi Biotec) dissoziiert und vor der Datenerfassung mit fluoreszierenden Antikörpern markiert. Für die Zytokin- und Granzym-B-Analyse wurden Tumorzellen in Gegenwart von Brefeldin A 5 Stunden lang ex-vivo mit PMA/Ionomycin stimuliert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gesammelt und auf intrazelluläre Ziele immungefärbt. Die Daten wurden mit einem Attune™-NxT-Durchflusszytometer (ThermoFisher Scientific) erfasst und anschließend mit der Flowjo-Software (BD) analysiert.

Abbildung 2: Analyse der entzündungsfördernden Reaktion in Effektorzellen im 4T1-luc-Modell. BALB/c-Mäuse mit etablierten 4T1-luc-Tumoren (n=6/Gruppe) wurden mit Anti-mCTLA-4 (Klon 9D9), fokaler Strahlung („RAD“; SARRP, Xstrahl Inc.), einer Kombination der beiden oder Isotyp-Kontrollantikörper behandelt. Die Tumore wurden in Einzelzellsuspensionen (gentleMACS™, Miltenyi Biotec) dissoziiert und vor der Datenerfassung mit fluoreszierenden Antikörpern markiert. Für die Zytokin- und Granzym-B-Analyse wurden Tumorzellen in Gegenwart von Brefeldin A 5 Stunden lang ex-vivo mit PMA/Ionomycin stimuliert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gesammelt und auf intrazelluläre Ziele immungefärbt. Die Daten wurden mit einem Attune™-NxT-Durchflusszytometer (ThermoFisher Scientific) erfasst und anschließend mit der Flowjo-Software (BD) analysiert.

Analyse der Degranulation in von CT26-Tumor abgeleiteten Effektorzellen nach Behandlung mit Anti-mCTLA-4

CD107a wird während der Degranulation auf der Zelloberfläche exprimiert und ist ein Marker, der üblicherweise zur Messung behandlungsinduzierter Auswirkungen auf die zytotoxische Aktivität verwendet wird. Das Cytokine/Cytotoxicity™-Panel wurde verwendet, um die Auswirkungen von Anti-mCTLA-4 auf die Lymphozytenzytotoxizität und das Tumorwachstum im murinen CT26-Darmtumor-Modell zu untersuchen. Mäuse mit CT26, die mit Anti-mCTLA-4 behandelt wurden, reagieren mit einer 74 % Tumorwachstumshemmung (Abbildung 3A). Um die Zytotoxizität zu untersuchen, wurde die CD107a- und Granzym-B-Expression in CD8+-T-Zellen, NK- und NKT-Zellen nach Ex-vivo-Stimulation von Tumorzellen mit PMA/Ionomycin gemessen. Repräsentative Expressionsprofile sind in Abbildung 3B dargestellt. Die Analyse zeigt, dass die Behandlung mit Anti-mCTLA-4 eine Erhöhung der CD107-Expression in allen drei Untergruppen im Vergleich zu mit Isotyp-Kontrolle behandelten Tieren auslöst. Gleichzeitig verringern sich die Granzym-B-Expressionsniveaus in NK- und NKT-Zellen. Die Daten lassen vermuten, dass die Granzym-B-Speicher in NK- und NKT-Zellen während der Degranulation aufgebraucht werden. Es ist zu beachten, dass sich die Granzym-B-Expression von CD8+-T-Zellen zwischen den Gruppen nicht unterschied, möglicherweise aufgrund eines Gleichgewichts in der De-novo-Expression von Granzym B, ausgelöst durch die Behandlung und die Degranulationsrate. Zusammengenommen steht dieser Phänotyp im Einklang mit einer behandlungsbedingten Verbesserung der Zytotoxizität und des Potenzials für eine direkte Abtötung von Tumorzellen.

Abbildung 3: Analyse der Zytotoxizität im CT26-Modell. BALB/c-Mäuse mit etablierten CT26-Tumoren (n=10/Gruppe) wurden mit Anti-mPD-1 (Klon RMP1-14) oder Isotyp-Kontrollantikörpern behandelt. Ex-vivo-Stimulation und Immunphänotypisierung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

Abbildung 3: Analyse der Zytotoxizität im CT26-Modell. BALB/c-Mäuse mit etablierten CT26-Tumoren (n=10/Gruppe) wurden mit Anti-mPD-1 (Klon RMP1-14) oder Isotyp-Kontrollantikörpern behandelt. Ex-vivo-Stimulation und Immunphänotypisierung wurden wie oben beschrieben durchgeführt.

Anpassung – Panel-Konfiguration zum Anpassen der Zytokin-Antworten

Das Cytokine/Cytotoxicity™-Panel ist vorkonfiguriert, um entzündungsfördernde Zytokine zu messen. Das Panel kann auch angepasst werden, um andere Zytokinreaktionen zu untersuchen. Zum Beispiel differenzieren Helfer-CD4+-T-Zellen in verschiedene CD4+-Effektor-Phänotypen, darunter Th1, Th2 und Th17. Diese Untergruppen spielen unterschiedliche Rollen bei der Tumorpathogenese. Th1-Zellen sind durch die Freisetzung von IFNγ gekennzeichnet, während Th2 und Th17 durch die Produktion von IL-4 bzw. IL-17 charakterisiert werden können. Das Cytokine/Cytotoxicity™-Panel kann so angepasst werden, dass es IL-4 und IL-17A enthält, um die mechanistische Analyse behandlungsinduzierter Effekte auf die Differenzierung von Helfer-T-Zellen in der Tumormikroumgebung zu erleichtern.

To learn more about how the Cytokine/Cytotoxicity™ panel can be incorporated into your preclinical oncology research, contact the scientists at Labcorp.


Verweise

1. Clynes, R. A., & Desjarlais, J. R. (2019). Redirected T cell cytotoxicity in cancer therapy. Annual Review of Medicine, 70, 437-450.
2. Miller, J. S., & Lanier, L. L. (2019). Natural killer cells in cancer immunotherapy. Annual Review of Cancer Biology, 3, 77-103.
3. Bae, E. A., Seo, H., Kim, I. K., Jeon, I., & Kang, C. Y. (2019). Roles of NKT cells in cancer immunotherapy. Archives of Pharmacal Research, 1-6.
 
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