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Umfassende Analyse der dendritischen Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des neuen CompDC™ Panels

Autor: David Draper, PhD | Stellvertretender Direktor, Wissenschaftliche Entwicklung​​​​​​​
Date: February 2019


To address the growing need for robust comprehensive DC immunophenotyping in murine pre-clinical models, we have configured a new standard panel, CompDC™. In diesem Tech-Spotlight werden wir zeigen, wie verschiedene DC-Untermengen in Tumor- und anderen aus Gewebe gewonnenen Zellproben mit Hilfe dieses Panels analysiert werden können.

T-Zell-vermittelte Anti-Tumor-Antworten hängen von der Aktivität der Antigen-präsentierenden Zellen (APC) ab, die das Tumor-assoziierte Antigen (TAA) präsentieren und den T-Zellen ko-stimulierende Signale liefern. Dies wiederum aktiviert tumorspezifische T-Zellen und löst ihre Expansion und Rekrutierung in den Tumor aus, wo sie ihre Wirkung entfalten. Dendritische Zellen (DC) sind professionelle APC, die an diesem Prozess maßgeblich beteiligt sind. DC können aktiviert werden, um zahlreiche kostimulatorische Liganden zu exprimieren, und können Antigen internalisieren und immunodominante Peptide sowohl für CD4+- als auch für CD8+-T-Zellen präsentieren. Die Entwicklung neuartiger Therapeutika, die sich die DC-Funktion zunutze machen, ist ein Gebiet, das intensiv untersucht wird. To facilitate these efforts and address the growing need for robust comprehensive DC immunophenotyping in murine pre-clinical models, we have configured a new standard panel, CompDC™. In diesem Tech-Spotlight werden wir zeigen, wie verschiedene DC-Untermengen in Tumor- und anderen aus Gewebe gewonnenen Zellproben mit Hilfe dieses Panels analysiert werden können.

For a general introduction to the different DC subsets and their function in cancer biology, read our blog “An Introduction to Dendritic Cell Biology and Analysis Using Syngeneic Immuno-Oncology Models” 

Das CompDC™-Panel ermöglicht es Wissenschaftlern zu bestimmen, ob In-vivo-Therapie die Häufigkeit und den Aktivierungszustand unterschiedlicher DC-Untergruppen im Tumor, in tumordrainierenden Lymphknoten (LN) oder anderen Wirtskompartimenten beeinflusst. Es handelt sich um ein 12-Farbpanel, das eine Reihe von Antikörpern kombiniert, die bei entsprechender Untersuchung verschiedene DC-Untergruppen abgrenzen und Einblick in das T-Zell-Aktivierungspotenzial der DC geben (Tabelle 1). Durch eine akribische Gating-Strategie erleichtert das Panel zunächst die DC-Analyse mit Präzision, indem es Makrophagen, Granulozyten und B-Zellen mit einem Ausschluss-Gate ausschliesst. Dieses Verfahren minimiert das Risiko, dass die DC-Analyse aufgrund einer Kontamination durch irrelevante oder autofluoreszierende Zellen beeinträchtigt wird. Anschließend wird CD24-Expression verwendet, um konventionelle DC-Untergruppen abzugrenzen, die im Allgemeinen nach mittleren bis hohen Expressionsniveaus von CD11c und MHC-Klasse II klassifiziert werden. Diese konventionellen DC umfassen die CD103+/CD8+ DC1-Untergruppe und die CD11b+ DC2-Untergruppe (Abbildung 1A), die nachweislich jeweils CD8+- und CD4+-T-Zell-Anti-Tumor-Antworten antreiben.[1] Die XCR1-Expression wurde von mehreren Gruppen als Marker für DC mit kreuzpräsentierender Aktivität dokumentiert, einem Phänotyp, der für die DC-vermittelte Aktivierung von CD8+-T-Zellen erforderlich ist.[2] Die Abbildungen 1B und 1C zeigen XCR1+-DC-Analyse in B16-F10-Tumorzellen und drainierenden Lymphknoten. XCR1-Expression ist im Allgemeinen mit der DC1-Untergruppe verbunden, wie gezeigt. Schließlich wird die Expression der Reifungsmarker CD80 und CD86 gemessen, um das kostimulatorische Potenzial der T-Zellen der DC zu bewerten. Abbildung 1D zeigt, dass die Expression dieser Marker auf DC in B16-F10-Melanomtumoren relativ gering ist, was auf die Immunsuppression hindeutet, die den DC durch die Tumor-Mikroumgebung (TME) vermittelt wird.

Tabelle 1: CompDC™-Panel-Antikörper und Beschreibung ihres Nutzens

Antikörper / Farbstoff Beschreibung  
CD45 Pan Immunzellmarker  

F4/80, Ly-6G, CD19

Ausschluss-Gate für Makrophagen, Granulozyten und B-Zellen  
CD11c Dendritische Zellmarker  
CD24 Dendritische Zellmarker  
CD8 DC1-Marker  
MHC-Klasse II Dendritische Zellmarker/Reifungsmarker  
CD103 DC1-Marker  
CD11b DC2-Marker  
XCR1 Marker für kreuzpräsentierende/migratorische dendritische Zellen  
CD80 Reifungsmarker  
CD86 Reifungsmarker  
Vitalitätsfarbstoff Ausschluss toter Zellen  
Das CompDC™ kann so angepasst werden, dass entzündliche DC (InfDC)- und Plasmacytoid-DC-Untergruppen durch Substitution in jeweils Ly-6C/CD206 und Siglec-H-Antikörpern analysiert werden können.  
Abb. 1: Analyse von DC-Untergruppen mit dem CompDC™-Panel. B16-F10 Melanom-Tumore wurden von Mäusen geerntet. DC1- und DC2-Untergruppenanalyse in tumorabgeleiteten Zellen (A), XCR1-Expression in CD103+ DC1-Zellen im Tumor (B) und Lymphknoten (LN) von B16-F10-tumortragenden Mäusen (C). Expression der kostimulatorischen Marker CD80 und CD86 in den gesamten tumorbedingten DC (D). Der rote Peak stellt zielgefärbte Zellen dar. Der blaue Peak stellt die ungefärbte Negativkontrolle dar.

Abb. 1: Analyse von DC-Untergruppen mit dem CompDC™-Panel. B16-F10 Melanom-Tumore wurden von Mäusen geerntet. DC1- und DC2-Untergruppenanalyse in tumorabgeleiteten Zellen (A), XCR1-Expression in CD103+ DC1-Zellen im Tumor (B) und Lymphknoten (LN) von B16-F10-tumortragenden Mäusen (C). Expression der kostimulatorischen Marker CD80 und CD86 in den gesamten tumorbedingten DC (D). Der rote Peak stellt zielgefärbte Zellen dar. Der blaue Peak stellt die ungefärbte Negativkontrolle dar.
 

Der CompDC™ kann auch für die Analyse von zwei zusätzlichen DC-Untergruppen angepasst werden. Dazu gehören entzündliche DC (infDC), die durch Substitution in Anti-CD206- und Anti-Ly-6C-Antikörpern durchgeführt werden. InfDC fördern nachweislich die Anti-Tumor-Aktivität und können aus dem monozytär-myeloischen Suppressorzellen(M-MDSC)-Gate als CD11c+MHCII+CD11b+CD206+-Zellen abgegrenzt werden (Abbildung 2A).[3] Plasmacytoid-DC (pDC) können auch durch Substitution in einem Anti-Siglec-H-Antikörper quantifiziert werden. Obwohl die pDC-Funktion in der TME noch nicht vollständig charakterisiert ist, haben viele Berichte gezeigt, dass diese pDC in ihrer Funktion beeinträchtigt sein und sogar eine immunsuppressive Wirkung auf Anti-Tumor-Antworten haben können.[4] pDC haben im Allgemeinen eine niedrige CD11c-Expression und sind positiv für Siglec-H, wie in Abbildung 2B gezeigt.

Abb. 2: Die Analyse von infDC- und pDC-Untergruppen wird durch Anpassung des CompDC™-Panels ermöglicht. (A) Analyse von infDC in B16-F10-tumorabgeleiteten Zellen. (B) Analyse von pDC in CT26-kolorektalen Karzinom-tumorabgeleiteten Zellen.

Abb. 2: Die Analyse von infDC- und pDC-Untergruppen wird durch Anpassung des CompDC™-Panels ermöglicht. (A) Analyse von infDC in B16-F10-tumorabgeleiteten Zellen. (B) Analyse von pDC in CT26-kolorektalen Karzinom-tumorabgeleiteten Zellen.

To learn more about the CompDC™ panel and how to incorporate it into your research, contact the scientists at Labcorp.


Verweise


1Gardner, A., & Ruffell, B. (2016). Dendritic cells and cancer immunity (Dendritische Zellen und Krebsimmunität). Trends in immunology, 37(12), 855-865.

2Wylie, B., Seppanen, E., Xiao, K., Zemek, R., Zanker, D., Prato, S. … und Waithman, J. (2015). Kreuz-Präsentation des kutanen Melanom-Antigens durch wandernde XCR1+ CD103- und XCR1+ CD103+ dendritische Zellen. Oncoimmunology4(8), e1019198.

3Kuhn, S., Yang, J., & Ronchese, F. (2015). Monocyte-derived dendritic cells are essential for CD8+ T cell activation and antitumor responses after local immunotherapy (Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen sind für die Aktivierung von CD8+-T-Zellen und Antitumorreaktionen nach lokaler Immuntherapie unerlässlich). Frontiers in immunology6, 584. 

4Mitchell, D., Chintala, S., & Dey, M. (2018). Plasmacytoid dendritic cell in immunity and cancer (Plasmazytoide dendritische Zelle bei Immunität und Krebs). Journal of neuroimmunology.

Bitte beachten Sie, dass die gesamte Tierpflege und -nutzung gemäß den Tierschutzbestimmungen in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung mit Überprüfung und Genehmigung des IACUC-Protokolls durchgeführt wurde.

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