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Ein tieferer Blick in den tumorinfiltrierenden T-Zell-Immunphänotyp

Autor: David Draper, PhD | Stellvertretender Direktor, Wissenschaftliche Entwicklung​​​​​​​
Date: August 2019


In diesem Tech-Spotlight demonstrieren wir die letztere Fähigkeit, indem wir Daten präsentieren, die mit dem neuen Expanded CompT™-Panel generiert wurden, einem 16-Farben-Feld, das die Flussanalyse der T-Zell-Aktivierung und -Differenzierung auf ein Niveau hebt, das über jedem anderen Feld im Serviceportfolio von Labcorp liegt.

Die Durchflusszytometrie unter Verwendung großer Antikörper-Panels hat den Vorteil, dass eine größere Anzahl von Zellteilmengen untersucht wird. Diese Fähigkeit ist besonders wichtig, wenn ein umfassender Datensatz erforderlich ist, jedoch nur begrenztes Tumormaterial für die Analyse verfügbar ist. Darüber hinaus können Panels mit einer großen Anzahl von Antikörpern verwendet werden, um einen tiefen immunphänotypischen Einblick in einige Untergruppen oder eine noch tiefere Analyse in eine einzelne Untergruppe zu ermöglichen. In this Tech Spotlight, we demonstrate the latter capability by presenting data generated using the new Expanded CompT™ panel, a 16-color panel that takes flow analysis of T cell activation and differentiation to a level above any other panel in the service portfolio. 

Das erweiterte CompT™-Panel baut auf dem CompT™-Panel auf, unserem beliebtesten Standardpanel zur Untersuchung von CD4+- und CD8+-T-Zellen. Dieses verbesserte Panel fügt Effektor- und Speicher-T-Zell-Marker sowie vier zusätzliche Marker zur Analyse der T-Zell-Aktivierung und -Erschöpfung hinzu. Tabelle 1 beschreibt die Komponenten des Expanded CompT™-Panels und unter Verwendung von unbehandelten murinen MC38-Kolonadenokarzinomen der Maus zeigt Abbildung 1 seine Gating- und Analysestrategie.

Tabelle 1: Erweiterte CompT™-Panel-Antikörper und Beschreibung ihres Nutzens

Antikörper / Farbstoff Beschreibung  
CD45 Pan Immunzellmarker  
CD3 Pan T-Zell-Marker  
CD4 CD4+-T-Zell-Marker  
CD8 CD8+-T-Zell-Marker  
FoxP3 Regulatorischer T-Zell-Marker  
CD25 Regulatorischer T-Zell-Marker/IL-2 Rezeptor  
CD44 Aktivierungs-/Memory-Marker  
CD62L Naive T-Zell-/Memory-Marker  
Ki-67 Proliferationsmarker​​​​​​​  
CD69 T-Zell-Aktivierungsmarker  
PD-1 T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarker  
LAG-3 T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarker  
TIM-3 T-Zell-Erschöpfungsmarker  
ICOS T-Zell-Aktivierungsmarker  
Granzyme B Anti-Tumor-Zytotoxizitätsmarker  
Vitalitätsfarbstoff Ausschluss toter Zellen  
Das Expanded CompT™ kann so angepasst werden, dass es NK/NKT-Zellmarker (CD49b/CD335) enthält, um die Expression von Granzym B und Aktivierungsmarkern in diesen Untergruppen zu ermöglichen.  

Erweiterte CompT™-Panel Gating-Strategie

As with all of our T cell panels, analysis begins with dead cell exclusion and subsequent CD45+ immune cell delineation to gate on CD3+ T cells (not shown). Abbildung 1A zeigt die Downstream-Endpunkte der gemeinsam genutzten CD4+- und CD8 -T-Zellanalyse zwischen den CompT™- und Expanded CompT™-Paneelen. Dazu gehören CD69 und PD-1, die bei Aktivierung der T-Zellen hochreguliert werden. Ihre Expression wurde mit dem erschöpften T-Zell-Phänotyp korreliert. [1] Ein weiterer gemeinsamer Endpunkt ist die CD8+-T-Zellproliferation, die durch Verwendung der Ki-67-Expression als Ersatzmarker bereitgestellt wird. Schließlich werden CD4+-T-Zellen untersucht, um Helfer-T-Zellen und regulatorische T-Zellen (Tregs) zu quantifizieren. Abbildung 1B und 1C veranschaulichen die hinzugefügten Endpunkte, die zum Erweitern des CompT™-Panels verwendet werden. Diese werden weiter unten beschrieben.

Abb. 1: Analyse von T-Zellen mit dem Expanded CompT™-Panel Naive MC38-Tumore wurden von C57 BL/6-Mäusen gesammelt. (A) CD4 + Helfer, CD8+-T-Zelle und Treg-Quantifizierung, einschließlich Messungen der Proliferation (Ki-67 Analyse) und CD69 }/PD-1 Markerausdruck. (B) Effektor/Memory-CD8+-T-Zell-Analyse zur Quantifizierung von naiven, Teff-, Tem- und Tcm-Teilmengen. (C) Erweiterte Analyse von T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarkern einschließlich Granzym B. Rote Peaks repräsentieren zielgefärbte Zellen. Blaue Peaks repräsentieren die nicht gefärbten Negativkontrollen.

Abb. 1: Analyse von T-Zellen mit dem Expanded CompT™-Panel Naive MC38-Tumore wurden von C57 BL/6-Mäusen gesammelt. (A) CD4 + Helfer, CD8+-T-Zelle und Treg-Quantifizierung, einschließlich Messungen der Proliferation (Ki-67 Analyse) und CD69 }/PD-1 Markerausdruck. (B) Effektor/Memory-CD8+-T-Zell-Analyse zur Quantifizierung von naiven, Teff-, Tem- und Tcm-Teilmengen. (C) Erweiterte Analyse von T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarkern einschließlich Granzym B. Rote Peaks repräsentieren zielgefärbte Zellen. Blaue Peaks repräsentieren die nicht gefärbten Negativkontrollen.

 

Effektor-/Gedächtnis-T-Zellen-Analyse

Die Analyse der Effektor- und Memory-CD8+ T-Zell-Differenzierung ist in Abbildung 1B dargestellt. Die Umwandlung von T-Zellen in einen Gedächtnisphänotyp ist wichtig für die Entwicklung einer dauerhaften immunologischen Reaktion auf eine erneute Herausforderung im Zusammenhang mit der Infektion und der Krebspathogenese. Die CD44- und CD62L-Analyse ermöglicht die Abgrenzung von T-Zellen in vier Differenzierungszustände. Dazu gehören naive oder inaktivierte T-Zellen, aktivierte Effektor-T-Zellen (Teff), Effektor-Speicher (Tem) und zentrale Speicher (Tcm). Tem- und Tcm-Untergruppen können zirkulieren, neigen jedoch dazu, sich in nicht-lymphoiden bzw. lymphoiden Geweben zu befinden. [2] Jüngste Berichte haben gezeigt, dass diese beiden Untergruppen unterschiedliche Rollen bei der Antitumorreaktion spielen. Eine Population des dritten residenten Gedächtnisses (Trm) spielt in jüngerer Zeit eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Tumorwachstums in einer Vielzahl von Modellen und kann unter anderem mit CD103 beschrieben werden. [3] Das erweiterte CompT™-Panel kann angepasst werden, um die Analyse von Trm-Zellen einzuschließen.

 

T-Zell-Aktivierung, Erschöpfung und Granzym B-Analyse

Das Expanded CompT™-Panel umfasst ICOS-, LAG-3-, TIM-3- und Granzym B-Analysen, vier intensiv untersuchte Biomarker für die T-Zell-Funktionalität (Abbildung 1C). Die Analyse dieser Ziele allein und in Kombination kann einen Einblick in das Antitumorpotential von CD8+-T-Zellen geben. Die Erkenntnisse stützen eine co-stimulierende und antitumorale Rolle für die ICOS-Rezeptorsignalisierung, wodurch ICOS zu einem attraktiven therapeutischen Ziel wird. [4] Granzym B wird häufig als Biomarker für die zytolytische Aktivität verwendet und kann mit Antitumorreaktionen von CD8+-T-Zellen korrelieren. Umgekehrt sind PD-1, LAG-3 und TIM-3 inhibitorische Rezeptoren, und während die Expression dieser drei Rezeptoren mit der Erschöpfung von T-Zellen in Verbindung gebracht wurde, deuten wachsende Daten darauf hin, dass innerhalb der erschöpften PD-1 exprimierenden CD8+-T-Zellen Heterogenität zwischen Subpopulationen besteht. [5] Diese Heterogenität korreliert mit dem Expressionsmuster dieser inhibitorischen Rezeptoren. Dieses Profil kann dabei helfen, verschiedene Subpopulationen zu definieren, die ein unterschiedliches Potenzial zur Wiederbelebung haben, um Tumorzellen zu vermehren und/oder zu lysieren. [6] Abbildung 2 zeigt, wie das Expanded CompT™-Panel Zellen mit doppelter und dreifacher positiver Expression für inhibitorische Rezeptoren quantifizieren und Einblick in die heterogene PD-1-exprimierende T-Zell-Untergruppe und ihre Funktionalität geben kann. Zahlreiche andere T-Zell-Aktivierungs- und Hemmrezeptoren wurden beschrieben und sind an der Beeinflussung der Tumorimmunantworten beteiligt. Dazu gehören TIGIT, OX-40, CD137, CTLA-4 und andere. We have experience analyzing many of these markers in ex vivo tumor analysis. Mit minimalem Entwicklungsaufwand kann der Expanded CompT™ an Ihre individuellen präklinischen Anforderungen angepasst werden.

Abb. 2: Multiplex-Analyse von T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarkern in naiven MC38-Tumor-abgeleiteten Zellen. Das Expanded CompT™-Panel misst die Koexpression mehrerer T-Zell-Biomarker gleichzeitig für Erschöpfung und Antitumoraktivität. In diesem Beispiel wurden zuerst PD1 + CD8 + T-Zellen eingegrenzt. Die nachgeschaltete Analyse quantifiziert dann Zellen mit doppelter und dreifach positiver Expression von PD-1, LAG-3 und TIM-3.

Abb. 2: Multiplex-Analyse von T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarkern in naiven MC38-Tumor-abgeleiteten Zellen. Das Expanded CompT™-Panel misst die Koexpression mehrerer T-Zell-Biomarker gleichzeitig für Erschöpfung und Antitumoraktivität. In diesem Beispiel wurden zuerst PD1 + CD8 + T-Zellen eingegrenzt. Die nachgeschaltete Analyse quantifiziert dann Zellen mit doppelter und dreifach positiver Expression von PD-1, LAG-3 und TIM-3.

 

Anpassung – NK/NKT-Zellanalyse und weitere Optionen

We can configure custom panels with up to 18 colors, which creates options for the MI-Expanded CompT™ panel. Neben dem Ersetzen oder Hinzufügen verschiedener T-Zell-Aktivierungs-/Erschöpfungsmarker, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, ist die NK/NKT-Zellanalyse ein potenziell wertvoller Endpunkt. Dies wird durch Hinzufügen von CD49b/CD335-Markern zum Bedienfeld ermöglicht (Abbildung 3).

Abb. 3: Erweiterte Anpassung des CompT™-Panels, um die Analyse von NK- und NKT-Zellteilmengen in naiven MC38-Tumorzellen zu ermöglichen. Die CD3-Expression wurde verwendet, um CD49b/CD335+ NK-Zellen und NKT-Zellen abzugrenzen. Die Expressionsniveaus von Granzym B in diesen Untergruppen wurden durch nachgeschaltete Analyse quantifiziert.

Abb. 3: Erweiterte Anpassung des CompT™-Panels, um die Analyse von NK- und NKT-Zellteilmengen in naiven MC38-Tumorzellen zu ermöglichen. Die CD3-Expression wurde verwendet, um CD49b/CD335+ NK-Zellen und NKT-Zellen abzugrenzen. Die Expressionsniveaus von Granzym B in diesen Untergruppen wurden durch nachgeschaltete Analyse quantifiziert.

NK- und NKT-Zellen sind eine wichtige Quelle für IFN, haben indirekte Auswirkungen auf die Verstärkung der Antitumorreaktionen von CD8+-T-Zellen und können Tumorzellen direkt lysieren, indem sie zytolytische Granulate wie Granzym B freisetzen. [7,8] Weitere Optionen sind IFNγ-, TNFα- oder andere Zytokinanalysen für ein detaillierteres Profil von PD1+ und PD1- CD8+-T-Zellen. Oder fügen Sie eine CD103-Analyse hinzu, um residente Gedächtnis-T-Zellen auf ein tieferes Gedächtnis-T-Zell-Profil im Tumor zu untersuchen. Our team has extensive experience developing custom flow cytometry services. Wenden Sie sich an die Wissenschaftler von Labcorp, um mehr darüber zu erfahren, wie das Expanded CompT™-Panel in Ihre präklinische Forschung integriert werden kann.

 


Verweise


1 Jiang, Y., Y. Li und B. Zhu. „T-Zell-Erschöpfung in der Tumormikroumgebung.“ Cell death & disease 6,6 (2015): e1792.

2 Klebanoff, Christopher A., Luca Gattinoni und Nicholas P. Restifo. „CD8 + T-Zell-Gedächtnis in der Tumorimmunologie und Immuntherapie.“ Immunological reviews 00211,1 (2006): 214-224 

3 Mami-Chouaib, Fathia et al. „Residente Gedächtnis-T-Zellen, kritische Komponenten in der Tumorimmunologie.“ Journal for immunotherapy of cancer 6,1 (2018): 87. 

4​​​​​​​ Amatore, Florent, Laurent Gorvel und Daniel Olive. „Induzierbarer Co-Stimulator (ICOS) als potenzielles therapeutisches Ziel für die Krebstherapie.“ Expert opinion on therapeutic targets 22,4 (2018): 343-351. 

5 Miller, Brian C., et al. „Untergruppen erschöpfter CD8+-T-Zellen vermitteln die Tumorkontrolle unterschiedlich und reagieren auf eine Checkpoint-Blockade. Nature immunology 20,3 (2019): 326.

6 Xiong, Huizhong, et al. „Die Koexpression von inhibitorischen Rezeptoren reichert aktivierte und funktionelle CD8+-T-Zellen in murinen syngenen Tumormodellen an.“ Cancer immunology research 7,6 (2019): 963-976.

7 Zhu, Yanting, Bo Huang, und Jue Shi. „Fas-Ligand und lytisches Granulat steuern die zytotoxische Dynamik natürlicher Killerzellen gegen das Krebsziel unterschiedlich.“ Oncotarget 7,3 (2016): 47163.

8 Zhao, Jie, et al. „Polyklonale natürliche Killer-T-Zellen vom Typ II benötigen PLZF und SAP für ihre Entwicklung und tragen zur CpG-vermittelten Antitumorreaktion bei.“ Proceedings of the National Academy of Sciences 111,7 (2014): 2674–2679.
 
Bitte beachten Sie, dass die gesamte Tierpflege und -nutzung gemäß den Tierschutzbestimmungen in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung mit Überprüfung und Genehmigung des IACUC-Protokolls durchgeführt wurde.

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